化妆品厂家oem,珠海水信生物科技有限公司关于枯草芽孢杆菌源纤维素酶基因的克隆[水信生物]

当前人们对于纤维素酶的研究主要集中在单一基因的克隆与表达,而结晶纤维素的降解需要多种纤维素酶的协同作用才能彻底完成.在将复杂的纤维多聚体转化为小分子糖类过程中,

化妆品厂家oem,纤维素酶复合酶系中的葡聚糖酶作用尤其突出.通过基因工程技术将不同功能的葡聚糖酶基因引入大肠杆菌内,可能是提高纤维素降解率的有效途径.利用分子技术改善纤维素酶的表达形式,将会加快纤维素酶在工农业生产中的应用进程,对解决能源危机,改善环境污染,减缓人畜争粮压力都具有重要意义.本试验研究了产纤维素酶枯草芽孢杆菌的筛选,

化妆品厂家oem,内切葡聚糖酶基因的克隆与表达,β-1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆与表达以及双纤维素酶基因在大肠杆菌中的融合表达,并分别对其酶活进行了评估.研究如下:1,为了分离产纤维素酶枯草芽孢杆菌,首先采用刚果红法对土壤样品进行筛选,

化妆品厂家oem,从中分离出14株产纤维素酶较高的菌株;酶活测定结果表明,菌株B.subtilis X1,B.subtilis X2对羧甲基纤维素底物有较强的降解能力,CMCA分别为6.93 U/m L和6.61 U/m L;对两菌株进行形态学,生理生化鉴定及16S r DNA分子鉴定,结果表明,B.subtilis X1,B.subtilis X2均为枯草芽孢杆菌.2,根据Gene Bank上提交的内切葡聚糖酶基因序列(ID:KF240848.1),设计并合成一对引物,以B.subtilis X1基因组为模板,采用PCR法扩增内切葡聚糖酶基因,并进行了T克隆和测序.

化妆品厂家oem,序列分析结果显示,目的基因全长为1506bp,ORF编码区为1500 bp,编码499个氨基酸,将测序结果与Gene Bank上注册的枯草芽孢杆菌源内切葡聚糖酶基因进行比对,同源性高达98.5%,表明本研究成功获取了枯草芽孢杆菌源内切葡聚糖酶基因,将其命名为Cel042.将Cel042克隆至表达载体p ET32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达.SDS-PAGE结果表明表达了一个约74 k Da的融合蛋白,酶活性分析显示z大CMCA为29.98 U/m L,是出发菌株B.subtilis X1酶活力的4.3倍,

化妆品厂家oem,表明枯草芽孢杆菌源内切葡聚糖酶基因Cel042在大肠杆菌中得到了有效表达.3,根据Gene Bank公布的枯草芽孢杆菌β-1,3-1,4葡聚糖酶基因序(KM:009051.1),设计并合成一对引物,利用B.subtilis X2基因组为模板,应用PCR技术获得了β-1,3-1,4葡聚糖酶基因,将其克隆至p MD18-T载体中并经生物公司测序.结果显示目的基因全长729 bp,

化妆品厂家oem,编码242个氨基酸.同源性分析表明本研究扩增的β-1,3-1,4葡聚糖酶基因与Gene Bank公布的JN039020.1同源性高达99.0%.结果表明本试验获取了枯草芽孢杆菌源β-1,3-1,4葡聚糖酶基因,并将其命名Cel22.将扩增的Cel22基因亚克隆到p ET32a(+)中,鉴定正确后,导入BL21(DE3)进行诱导表达.

化妆品厂家oem,SDS-PAGE结果表明表达了一个约44 k Da的融合蛋白,酶活性检测发现,本试验表达的β-葡聚糖酶CMCA高达20.87 U/m L,是出发菌株B.subtilis X2酶活的3.2倍.4,为将两基因融合,设计合成了两对引物,并在Cel042基因和Cel22基因之间加上了一段连接肽(GSGGGS),然后分别对两基因进行PCR扩增,通过酶切连接将两基因连接得到Cel042-Cel22.

化妆品厂家oem,将融合的双纤维素酶基因Cel042-Cel22插入p ET32a(+)中构建重组表达载体p ET32a-Cel042-Cel22,转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)进行融合表达.SDS-PAGE结果表明表达了一个约101 k Da的融合蛋白.酶活测定结果显示融合纤维素酶酶活效力可达57.62U/m L,酶学性质研究表明酶反应的z适温度为50℃,

化妆品厂家oem,z适p H为6.0;纯化后的酶在p H 4~8之间保持75%以上活性.温度在40~70℃之间,可维持70%酶活效力.Mn2+对该酶有较强复苏作用,而Hg2+和乙二胺四乙酸(EDTA)则抑制作用明显.不同纤维素酶的融合表达形式,为研究新的纤维素降解途径奠定了基础.

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